БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТИЛОВОГО СПИРТА

 

О.В.Мосин

 

В основе биотехнологического получения этилового спирта, кормовых и пищевых дрожжей, пивоварения и виноделия лежит процесс брожения - один из разновидностей биологического окисления субстрата у гетеротрофных микроорганизмов. Биотехнологические бродильные процессы изучены сравнительно давно. Однако некоторые процессы брожения реализованы на практике только сейчас. В основе брожения лежит универсальная реакция превращения источника углерода глюкозы в ключевой промежуточный продукт-пировиноградную кислоту, из которой синтезируются дальнейшие продукты, включая этиловый спирт. Возбудителями спиртового брожения могут быть дрожжи — сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы (Aspergillus oryzae) и бактерии (Erwinia amylovora, Sarcinaventricula, Zymomonas mobilis, Z. anaerobia).

 

По расходу сырья производство этилового спирта самое крупное биотехнологическое производство в мире. Однако по стоимости валового продукта этанол занимает третье место среди крупнотоннажной продукции.

Как известно, этанол широко исполь­зуется в химической, фармакологической и пищевой промыш­ленности. Кроме того, он может стать источником энергети­ческих ресурсов.

На схеме показаны основные пути использования эта­нола.

 

 

 

Из этанола получают этилен — традиционное сырье для органического синтеза. Из 3,8 кг сахара можно получить 1,7 кг этанола, из него — 1 кг этилена. Этанол как жидкое топливо пока не может конкурировать с бензином, поскольку, например в США, полученный из зерна этанол в 2—3 раза дороже бензина. Существуют национальные программы замены части бензина (до 20%) этанолом как топлива для автомобильного транспорта, что позволит уменьшить импорт нефти. Бразилия еще в 1992 г. планировала получить из тростникового сахара 3,8 млрд л этанола, чтобы сократить импорт нефти на 4 млрд долларов.

 

 

 

 

 

Таблица 1 Характеристика микроорганизмов — продуцентов этанола

(Ю. Швинка, Л. Панкова,  1984)

 

	Оптимальные пара-		Выход	Макси-
Микроорганизмы	метры культивиро­вания		этанола, %от макси­мального	мальная концент­рация этанола, г/л	Примечания
	рн	Темпера­тура, °С
Saccharomyces ce-	3—4	30	100	130	Не используют пенто-
revisiae					ЗЫ
Saccharomyces ro-	4,6	35	88	42,5	Конвертирует    в  эта-
sei Kluyveromyces ma-	4,4	35	88	44	нол полисахариды то­пинамбура   (инулин) То же
rxianus
Pachysolen   tanno-philus	4,2	25	40—60	20	Использует    ксилозу, растет   в   смешанной
Zymomonas mobilis Zymomonas   anae-robia	5,5 5,6	30 35	95 90—95	130 96	культуре Аэротолерантеп Термоустойчив
Clostridium     ther-mocelium	7,0	62	50	1,5	Образует      активный целлюлазный      коми-

Clostridium     ther-     6,9—7,5     67—70
mohydrosulfuricum

Clostridium     ther-                        55—60

mosaccharolyticum

Termoanaerobacter     5,8—8,5         69
ethanolicus

 

Необходимо отметить, что производство спирта — одна из самых старых отраслей биотехнологии. Хорошо изучены различные продуценты этанола, биохимия процессов спиртового бро­жения. Материальный баланс спиртового брожения имеет следующий вид:

С_nН_2nО_n + 0,005 NН₃ — 0,04 X + 0,49 С₂Н₅ОН + 0,47 СО₂.

биомасса

Энергия субстрата в процессе брожения распределяется так:

90%   переходит  в  этанол   и   по  5% — в   биомассу   и  теплоту.

В качестве продуцента в спиртовом производстве используют только дрожжи, однако, как видно из таблицы 1, этанол также продуцируют многие бактерии..

В качестве сырья для производства этанола в различных странах используют национальные доступные растительные источники: зерновые, картофель и свекловичная масса – в России, Украине, Беларуси; сахарозу и тростниковую мелассу – в США; рис – в Японии и т.д. В обозримом будущем любой источник растительного сырья может использоваться для производства этанола; целлюлоза в древесине, соломе, торфе и т.д. Поэтому сульфитные щёлока - отходы целлюлозно-бумажной промышленности находят всё более широкое применение в биотехнологии этилового спирта.  Так, на сульфитных щелоках можно получать грибную биомассу с использованием ацетат-утилизирующего сапрофитного микроорганизма Paecilomyces varioti, как это разработано в Финляндии.  

В настоящее время у нас на производство этанола расходуется более половины ресурсов растительной мелассы. Отечественными биотехнологами разработа­на технология комплексной переработки мелассы с получением из 1 т мелассы 310—320 л этанола, 100 кг прессованных хлебо­пекарных дрожжей, 80—85 кг кормовых дрожжей (сухих), 10— 13 кг диоксида углерода. Кроме того, после дрожжевую барду, содержащую 6—7 % СВ, можно упаривать до 60 % и исполь­зовать как кормовую добавку или как сырье для получения гранулированного органо-минерального удобрения. При дистилляции спирта получают еще и сивушные масла в количестве 1 л на 200 кг этанола. Сивушные масла содержат спирты изо-амиловый (62%), пропиловый (12%) и изобутиловый (15%).

 

 

 

 

 

Рис.1.   Annapатурно-технологическая   схема   получения   этанола   из   мелассы:

/ — рассиротшики, 2—4 ---   аппараты чистой культуры, 5 — стерилизатор, 6 — дрожже-генератор,  7 —  насос, 8   --  бродильный  аппарат,  9   --  головной  бродильный  аппарат

 

Существует много технологических вариантов реализации процесса спиртового брожения. На рис. 1 представлена схема двухпоточного способа сбраживания мелассы. Данная схема предусматривает приготовление отдельных сред для получения дрожжей (концентрация СВ 8—12%) и для сбраживания (32— 36% СВ); соотношение этих сред (1 Ч- 1,2):1. В дрожжегенераторах применяют аэрацию 3—4 м³/(м³-ч), поддерживают тем­пературу 28—30 °С и рН 4,2—4,5. Концентрация этанола в дрожжегенераторах достигает 2,8—3,5 % об., дрожжей — 2,5— 6,5 % СВ. Выращенные дрожжи из дрожжегенераторов по верх­ним линиям отбора направляют в головной бродильный аппарат, куда одновременно поступает среда с концентрацией СВ 32— 36 %. После заполнения головного аппарата культуральная жид­кость последовательно проходит бродильные аппараты и из пос­леднего поступает на перегонку. Температура брожения 29— 31 °С. Концентрация СВ в первом бродильном аппарате 7,5— 8,5%, во втором — 8,0—9,0%, в третьем — 9,0—9,5% и в пос­леднем — 5,0—6,5 %. Система работает без возобновления дрожжей 7—10 сут и обеспечивает получение 66,5 дал спирта из 1 т условного крахмала.

Перед перегонкой из бражки выделяют хлебопекарные дрожжи, а на барде выращивают кормовые дрожжи. Важным вопро­сом в крупнотоннажном производстве этанола, является выбор сырья. Во внимание принимают главным образом экономические аспекты — доля затрат на сырье в общей себестоимости. Существенное значение имеет количест­во этанола, которое получают из растительного сырья, выращен­ного на 1 га. Как видно из табл. 2, из сахарного трост­ника получается максимальное количество этанола — 4032 л/га, из мелассы — 878 л/га, из картофеля — 166 л/га.

Таблица 2. Выход этанола при переработке различного сельскохозяйственного сырья

 

	Урожайность,	Исходное со-	Выход этанола
Сырье	т/га	держание угле-
		водов, %	л/т	Л/га
Сахарный тростник                 56                        13 — 14               67—76				4032
Кассава                                        8,2                        30                 172—194				1592
Кукуруза                                       3,2                        60                 345—388				1172
Меласса тростниковая         2,4—4,0                     50                 258 — 291				878
Картофель                                    1,6                         17                   98—110				166

В настоящее время значительный интерес для производства этанола представляют аэротолерантные бактерии Zymomonas mobilis. В отличие от дрожжей эти бактерии характеризуются отсутствием катаболитной репрессии и низкой чувствительностью к этанолу. Кро­ме того, удельная скорость потребления глюкозы и образования этанола у них в 2—3 раза выше (Q _глюк= 3,75; Q_эт. = 1,87 г/(г-ч). Zymomonas mobilis утилизируют глюкозу, фруктозу, а некоторые штаммы также сахарозу, причем катаболизм глюкозы идет по пути Энтнер — Дудорова (рис. 2). В сахарозных средах изо­лированный штамм продуцирует также фруктозный полисаха­рид леван, сорбитол и глюконовую кислоту.

Штаммы, дефицитные по фруктокиназе, сбраживают глюкозу до эталона, при этом в среде накапливается фруктоза, что позволяет получить из сахарозы этанол и фруктозу.

 

Рис. 2. Схема катаболизма у Zymomonas mobilis:

1—глюкокиназа, 2—глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 3—6-фосфоглюконатдегидро-геназа, 4— 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза; 5 — дегидрогеназа 3-фосфо-глицеринового альдегида; 6 — фосфоглицераткиназа, 7— фосфоглицеромутаза, 5—енолаза, 9 — пируваткиназа, 10 — фруктокиназа, // — фосфогексоизомераза, 12 — левансахараза, 13 — глюконокиназа, 14 — глюкозофруктозотрансгидрогеназа

 

Так как скорость роста биомассы Zymomonas mobilis невелика, в среде обычно накапливается 2—3 г/л биомассы, что отрицательно влияет на продуктивность системы. В связи с этим практикуют либо искусственную иммобилизацию клеток, либо используют флокулирующие штаммы, например штаммом ZM-4, полученным П. Роджерсом, Л. Аркури с сотр. Исполь­зуя иммобилизованные клетки Zymomonas mobilis в среде, содержащей 10 % глюкозы, достигли в противоточном режиме про­дуктивности системы по этанолу 152 г/(л-ч). Максимальная

продуктивность при работе с Saccharomyces cerevisiae 80 г/ (л x ч). К сожалению, на мелассных средах продуктивность Z. mobilis ниже.

Крупные успехи по получению этанола при культивировании Z. mobilis достигнуты в Канаде (Н. Lawford et. al., 1989). В результате целенаправленной селекции флокулирующего штам­ма и оптимизации процесса ферментации продуктивность системы по этанолу составляет до 200 г/(л-ч), что почти на 2 порядка превышает продуктивность ферментационного процесса на боль­шинстве спиртовых заводов. При получении этанола химичес­ким путем из этилена продуктивность составляет 80 г/(л-ч).

Сейчас в биотехнологии этанола широко применяют флокулирующие штаммы, которые позволяют повысить концентрацию биомассы до 40—60 г/л. Однако возникают проблемы, связанные с интенсивным выде­лением диоксида углерода, который коалестирует и нарушает гомогенность процесса. Чтобы предотвратить эти нежелатель­ные явления создана многоступенчатая вертикальная колонна. Внутри ее установлен ряд усеченных конусов, обращенных боль­шим основанием к верху. Через нижнее отверстие конуса вверх поднимается жидкая фаза с продуцентом, а газ накапливается в пространстве между верхней наружной частью конуса и цилиндром. Оттуда через патрубок выводится СО2 из биореактора в общий вертикальный коллектор. При переработке мелассы тростникового сахара с концентрацией сахара 160 г/л с по­мощью флокулирующей культуры Saccharomyces uvapum биореактор работает 460 ч при D = 0,18 ч ^-1. Содержание этано­ла 7—8 % °б. Содержание клеток в 1 мл сброженного субстра­та не более 10. С помощью колонного ферментатора в опытах Кастро (X. Castro, J. D. Bu-Lock, 1989) достигнута продуктив­ность по этанолу на глюкозной среде 22,5 г/(л- ч), на мелассной среде — 9,6 г/(л-ч), на крахмальной — 2,2 г/(л-ч). Необходимо отметить, что при ферментации крахмала были совмещены процессы осахаривания с помощью иммобилизован­ной амилоглюкозидазы и спиртового брожения с помощью дрож­жей.

Интересные результаты при сбраживании высококонцентрированных крахмальных субстратов получены в условиях совме­щенного процесса осахаривания и спиртового брожения с по­мощью культур Rhizopus sp. и Saccharomyces cerevisiae (F. В. Elegado, et. al., 1989) в биореакторе с циркуляцией газа. При концентрации субстрата 265 г/л через 3 сут этанола содер­жалось 11 % об. Такой выход достигается за счет того, что при циркуляции этанольные и водяные пары переходят в газ. Этанол из газа можно конденсировать при концентрации суб­страта в системе 400 г/л, содержание этанола в конденсате достигает 35,2 %.

В связи с ограничением ресурсов традиционного сырья для производства этанола сейчас разрабатываются процессы на основе но­вых заменителей сахара. К ним можно отнести синтетический газ, получаемый из угля. Как известно, этот газ состоит из СО, Н2 и СО₂. Выделены бактерии, способные конвертировать СО и Н2 до этанола согласно уравнениям (К. Т. Klavon et al., 1989):

6СО + ЗН₂О - С₂Н₅ОН + 4СО₂;

6Н₂ + 2СО₂ — С₂Н₅ОН + ЗН₂0.

При получении этанола из синтетического газа большое значение имеет оптимизация массообмена между газовой, жидкой и твердой фазами. В колонном аппарате можно получить кон­центрацию этанола 2—3 %.

Важным достижением в области рационального использования растительного сырья является раскрытие биохимических и генетических основ биоконверсии ксилозы в этанол. Микро­организмы, способные трасформировать D-ксилозу в этанол, должны иметь два фермента. Первый фермент — NADH-зави-симая ксилозоредуктаза — катализирует превращение D-ксилозы в ксилит, второй —- NAD-зависимая ксилитдегидрогеназа — окисляет ксилит в D-ксилулозу. Последняя через пентозный шунт и по гликолизному пути может конвертироваться в эта­нол (Err—Cheng Chan et. al., 1988).

Однако этот биохимический механизм трудно поддается регуляции, поэтому методами генетической инженерии необходимо было ввести в клетки ген, кодирующий синтез ксилозоизомеразы — фермента, обеспечивающего прямую конверсию D-кси-лозы в D-ксилулозу. Такой ген был трансплантирован в дрож­жи Schizosaccharomyces pombe при помощи ксилозоизомеразной плазмиды Е. coll. Ген интегрировался с хромосомальной ДНК дрожжей и обеспечил экспрессию ксилозоизомеразы, что поз­волило сбраживать ксилозу до этанола. В результате продук­тивность штамма по этанолу увеличилась с 0,063 до 0,177 г/(л- ч). Таким образом стало возможным при помощи Schizosaccharomy­ces pombe сбраживать в этанол не только D-глюкозу, получаемую после гидролиза целлюлозы, но и D-ксилозу, получаемую после гидролиза гемицеллюлозы.

Показана также возможность биоконверсии глюкозы и ксилозы в этанол при непрерывном культивировании Thermoanaerobacter ethanolicus. Выход этанола из ксилозы составил 0,42 г/л (L. S. La-cis, H. G. Lawford, 1988).

Во многих лабораториях у нас и за рубежом интенсивно изучается бактериаль­ный синтез этанола с использованием целлюлозосодержащих видов сырья. Предполагается, что термофильная анаэробная фер­ментация целлюлозосодержащих субстратов рентабельна при кон­центрации этанола выше 4,5 %. Однако в настоящее время испы­тывают методы интенсификации спиртового производства, осно­ванные на использовании различных штаммов дрожжей. 75 % мирового производства биоэтанола получают в периодическом процессе при средней длительности цикла 36 ч и содержании эта­нола в среде 6% (47 г/л). Можно отметить следующие методы интенсификации спиртового брожения:

1) непрерывная ферментация (вместо периодической), что поз­воляет увеличить продуктивность системы по этанолу до 5—6 г/л в час вместо 1,8—2,5 г/(л- ч). Однако длительная ферментация приводит к возникновению малопродуктивных, но быстрорастущих мутантов, к тому же скорость образования этанола лимитируется вследствие его ингибирующего действия;

2) непрерывная ферментация с применением флокулирующих продуцентов, что позволяет повысить концентрацию биомассы дрожжей до 40—80 г/л и увеличить продуктивность системы до 30—50 г/(л- ч);

3) непрерывная ферментация с рециркуляцией биомассы, что обе­спечивает продуктивность 30—40 г/(л- ч);

4) непрерывная ферментация с использованием иммобилизован­ных клеток, что обеспечивает продуктивность системы 25—30 г/(л- ч);

5) вакуумная ферментация при разрежении 32—35 мм рт. ст. с целью удаления этанола и уменьшения его ингибирующего действия. Продуктивность системы достигает 80 г/(л- ч). Недостат­ком этого метода является накапливание в среде нелетучих про­дуктов, что затрудняет газообмен и вызывает опасность контами­нации;